Задание 1:
внимательно прочитайте содержание работы № 2;
законспектируйте технику микроскопирования и правила работы с микроскопом в рабочую тетрадь.
Установить микроскоп у края стола против левого плеча. С правой стороны расположить открытый альбом для практических занятий. Протереть окуляр марлевой салфеткой. Обратить зеркало микроскопа вогнутой стороной к источнику света.
Привести микроскоп в рабочее состояние:
установить объектив малого увеличения на расстоянии 1-1,5 см от предметного столика;
поднять конденсор до предела;
смотря в окуляр одним глазом, не закрывая другого, равномерно и интенсивно осветить зеркалом поле зрения;
Поместить препарат на предметный столик микроскопа покровным стеклом кверху (обратить на это внимание). Передвигать препарат большим и указательным пальцами за ребро с тем, чтобы найти место, подлежащее изучению; средний палец должен упираться в предметный столик.
Опустить конденсор до положения, обеспечивающего наилучшее освещение препарата на малом увеличении.
Рассмотреть препарат с помощью 8- или 10-кратного объектива (малого увеличения). Найти место, подходящее для изучения при большом увеличении, поставить его в центр поля зрения и отрегулировать резкость изображения микровинтом.
При переходе с малого увеличения на большое необходимо, не меняя фокусного расстояния, повернуть револьверную пластинку объективов до щелчка, чтобы в рабочее положение встал 40-кратный объектив (большого увеличения). Микровинтом добиться резкого изображения. Работа макровинтом на большом увеличении запрещается, так как легко можно раздавить препарат.
Левая рука должна находиться на микрометрическом винте, слегка поворачивая его в обе стороны для просматривания деталей среза, лежащих на разной глубине поверхности среза.
Уяснив пространственное положение, пропорции и взаимоотношения деталей изучаемого объекта, приступить к зарисовке.
Запрещается снимать препарат из под объектива большого увеличения. Для того, чтобы убрать препарат с предметного столика микроскопа в рабочее положение ставится объектив малого увеличения и препарат снимается с предметного столика микроскопа.
Запрещается развинчивать какие-либо части микроскопа. В случае неисправности микроскопа обращаться к преподавателю .
Задание 2:
подготовьте микроскоп к работе, по вышеизложенным правилам работы с микроскопом под пунктами 1-2;
получите микропрепарат (любой) у преподавателя;
получите резкое изображение сначала на малом, а затем на большом увеличении микроскопа согласно пунктам 3-7 правил работы с микроскопом;
рассмотрев микропрепарат, правильно снимите его с микроскопа, согласно пункту 9 правил работы с микроскопом.
РАБОТА № 3. ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВРЕМЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Задание 1:
внимательно прочитайте содержание работы № 3;
приготовьте временный препарат.
Возьмите предметное стекло из чашки Петри, держа его за боковые грани, и положите на стол. Отделите от кусочка луковицы мясистую чешуйку. На внутренней ее стороне находится тонкая пленка. Снимите ее пинцетом и отрежьте кусочек пленки размером несколько квадратных миллиметров. Положите этот кусочек на предметное стекло, наберите пипеткой раствор йода, капните каплю йода на пленку и накройте покровным стеклом (обязательно держа его за боковые грани, чтобы не оставить следов от пальцев).
Задание 2:
ознакомьтесь с нижеизложенным описанием микроскопической картины временного препарата;
получите изображение временного препарата на малом увеличении и рассмотрите его;
получите изображение временного препарата на большом увеличении и рассмотрите его.
Рассмотрите препарат на малом увеличении. На препарате видна группа клеток, имеющих вытянутую, почти прямоугольную форму. Крупные округло-овальные ядра в клетках окрашены йодом в желто-коричневый цвет. Переведите объектив на большое увеличение и найдите двухконтурную оболочку клетки. Обратите внимание на её толщину. При внимательном рассмотрении цитоплазмы клетки видна ее зернистая структура. Ядро обычно занимает срединное положение в клетке. Иногда оно смещено к оболочке и приобретает сплющенную форму. В ядре можно заметить 1-2 ядрышка. Неокрашенные пустоты в цитоплазме клеток представляют собой вакуоли.
Задание 3:
в рабочей тетради выполните зарисовку микроскопической картины временного препарата клеток кожицы лука, предварительно ознакомившись с образцом зарисовки и содержанием работы № 4.
Зарисуйте несколько клеток. На рисунке должны быть обозначены: 1) ядро 2) цитоплазма; 3) двухконтурная оболочка.
ОБРАЗЕЦ ОФОРМЛЕНИЯ ЗАРИСОВКИ:
Препарат: Кожица лука.
Окраска: спиртовый раствор йода.
РАБОТА № 4 . ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ.
Задание 1:
внимательно прочитайте правила оформления протокола практического занятия;
законспектируйте правила оформления протокола практического занятия в рабочей тетради.
На практических занятиях необходимо иметь при себе тетрадь, ручку, карандаш простой, карандаши цветные, линейку, ластик.
В тетрадях для практических занятий студент записывает дату проведения занятия. Затем, следуя методическим указаниям, записывает номер и тему занятия, далее – номер работы, название работы и последовательно выполняет все задания к каждой работе.
При выполнении зарисовок следует выполнять следующие правила :
На практическом занятии при исследовании препарата студент в поле зрения наблюдает определенную микроскопическую картину. Результаты микроскопического исследования препарата обязательно документируются. Это может быть выполнено путем микрофотографирования или зарисовки микроскопического изображения (поля зрения, либо его части). Зарисовка является обязательным профессиональным практическим навыком студента. Правильный рисунок микроскопического изображения, выполненный в результате работы с препаратом, является единственным свидетельством освоения материала на практическом занятии.
До начала зарисовки вверху страницы пишется название номер и название работы, ниже - название препарата. При изучении простейших, гельминтов, насекомых указывается систематическое положение объекта в соответствии с международной номенклатурой, при этом обозначение типа, подтипа, класса пишется на отдельной строке по-русски и по-латыни.
Требование к рисунку:
рисунок располагается в левой части листа;
рисунок выполняется аккуратно, крупно, простым или цветным карандашами, с хорошо различимыми деталями;
на одной странице размещается не более 2 рисунков;
рисунок должен правильно отображать форму, соотношения объема и размеров (длина, ширина и др.) отдельных частей и целого объекта;
контур поля зрения микроскопа вокруг рисунка не зарисовывается.
К каждому рисунку должны быть сделаны обозначения его отдельных частей.
Требования к обозначениям:
к отдельным частям простым карандашом ставят стрелочку и против каждой пишут определенную цифру;
справа от рисунка сбоку от рисунка столбиком по вертикали располагают арабские цифры, против цифр – названия.
Оформленная практическая работа в конце занятия представляется для проверки ведущему преподавателю. При отсутствии замечаний по форме и содержанию работы преподаватель расписывается в тетради.
Последняя четверть XIX столетия ознаменовалась углублением исследований строения тканей и клеток, что сделалось возможным вследствие успехов, достигнутых в усовершенствовании микроскопа и особенно в разработке тех приемов микроскопического исследования, какими мы пользуемся и в настоящее время.
Высокие и неуклюжие, на наш взгляд, микроскопы первой половины XIX в. во второй его половине принимают более практичные формы. Укорачивается тубус, устанавливается стандартная высота предметного столика. Штатив становится более массивным и устойчивым, ножка его, которой ранее придавалась круглая форма или вид треножника, теперь устраивается чаще всего в виде подковы, что дает лучшую устойчивость. Отверстие предметного столика снабжается диафрагмами в виде сменяющихся цилиндров или круга с отверстиями разного диаметра, вращающегося под предметным столиком. Все микроскопы снабжаются микрометрическим винтом, а большие штативы, кроме того, кремальерой.
Окуляры начинают изготовлять более светосильными, причем обращается внимание на выпрямление поля зрения. Особенные улучшения были достигнуты в конструкции объективов. Уже в первой половине XIX в. некоторые фирмы изготовляли объективы, дававшие с сильными окулярами увеличение более чем в 1000 раз. Но практическое применение таких сильных систем было ограничено тем, что поле зрения становилось темным, так как при малом фокусном расстоянии значительное количество лучей, преломляясь в воздухе, отклонялось и не попадало в объектив. Коренное улучшение было достигнуто введением иммерсионных объективов.
Принцип иммерсии, т. е. погружения объектива в жидкую среду, помещенную между объектом и фронтальной линзой, предложил в 1850 г. Дж. Амичи. Вначале он употреблял для иммерсии растительное масло, но отличия в показателе преломления заставили заменить масло водой. Хотя вода также отличалась по показателю преломления от стекла, все же водная иммерсия была известным достижением и для некоторых специальных целей употребляется и в наше время.
Во второй половине прошлого века появилось большое число оптических фирм, изготовлявших микроскопы. Кроме уже ранее получившей известность фирмы Шевалье, продолжает работу оптический институт Оберхейсера; из Франции он был переведен в Германию и в Потсдаме продолжал деятельность под фирмой Гартнака (Hartnack). В 1859 г. эта фирма внесла в конструкцию иммерсионных объективов некоторые улучшения, и в 60-х и 70-х годах микроскопы Гартнака считались одними из лучших. Продолжала деятельность фирма Шик в Берлине. Бывший институт Фраунгофера под фирмой Мерц (G. und С. Merz) изготовлял большие штативы с многими объективами и механическими приспособлениями. В 1849 г было организовано производство микроскопов в Ветцларе (Германия), позже получившее широкую известность под фирмой Лейтца (Ernst Leitz).
Прогресс в конструкции микроскопов во второй половине XIX в. неразрывно связан с немецкой оптической фирмой Цейсса, обязанной своими успехами выдающемуся физику Аббе.
В 1846 г. оптик Карл Цейсс (Cazl Zeiss, 1816-1888) основывает в Иене мастерскую, которую талант и выдающиеся способности Аббе превратили в оптический институт мирового значения. Личность Аббе представляет, помимо его научных заслуг, большой интерес. Сын ткацкого мастера в Эйзенахе, в детстве видевший нужду в семье, Эрнст Аббе (Ernst Abbe, 1840- 1905) уже мальчиком обнаружил исключительные способности, обратившие на него внимание учителей, настоявших на его дальнейшем образовании. По окончании университета Аббе занимает кафедру теоретической физики в Иене (1870), а позже становится директором Иенской обсерватории (1877-1890). По предложению Цейсса, состоявшего университетским механиком, Аббе принимает участие в работах организованных Цейссом оптических мастерских, становится совладельцем, а до смерти Цейсса владельцем фирмы. Однако Аббе отказался от прав владельца предприятия и, сохранив за собой руководство, передал доходы от предприятия в пользу рабочих и служащих Аббе разрабатывает математически теорию микроскопа, доведя до предела оптические возможности светового микроскопа. По его инициативе и под его руководством при заводе организован научный оптический институт, где разрабатывается система измерений, дающих научный критерий для оценки качеств микроскопа. Создаются новые сорта стекла (по инициативе Аббе создано известное производство «иенского стекла» Шотта); производство микроскопов становится на подлинно научное основание. Н. А. Умов (1846-1915), выдающийся русский физик, в проникновенной статье, посвященной памяти Аббе, писал: «Аббе заменил работу ощупью и наугад точным теоретическим вычислением наиболее выгодных форм оптических стекол, их кривизны и взаимных расстояний в связи с физическими свойствами стекол, из которых они должны быть изготовлены. Через несколько лет упорного труда микроскопы Цейсса, построенные по указаниям Аббе, превзошли по своим качествам все до того времени известные» (Н. А. Умов, 1905).
Первым крупным достижением оптического института Цейсса явилось изготовление масляного иммерсионного объектива, так называемой гомогенной иммерсии, основанной на применении кедрового масла. Этот объектив был рассчитан на применение в качестве иммерсионной среды кедрового масла и имел неоспоримое преимущество перед водной иммерсией Амичи. Масляный иммерсионный объектив был изготовлен впервые в 1878 г. по указанию Стефенсона (Stephenson) в Лондоне и под руководством Аббе. Это было крупнейшим достижением в технике микроскопии. Исследователь получил сильный объектив, который давал возможность применять большие увеличения, не ослабляя освещенности поля зрения. Масляная гомогенная иммерсия быстро завоевала признание и обусловила успехи цитологии в последней четверти прошлого века.
Применение масляной иммерсии требовало реконструкции системы освещения объекта. Еще в 1873 г. Аббе конструирует особый осветительный аппарат, позволяющий использовать все достоинства нового объектива. Этот «осветительный аппарат по Аббе» становится обязательной частью всякого исследовательского микроскопа.
По вычислениям Аббе фирма Цейсс выпустила в 1886 г. новые объективы-апохроматы, где коррекция сферической и хроматической аберрации доведена до предела. В комбинации с особыми компенсационными окулярами апохроматы явились последним словом оптической техники светового микроскопа. Как показали исследования Аббе, изготовлением апохроматов с высокой апертурой достигнут предел разрешающей способности линз микроскопа, поставленный длиной светового луча (в нашем веке этот предел возможностей микроскопического исследования преодолен изобретением электронного микроскопа). Аббе сконструировал также рисовальный аппарат, позволяющий производить точную зарисовку микроскопических объектов.
Достижения Аббе были использованы другими фирмами, получившими известность во вторую половину прошлого столетия. В Ветцларе в 1873 г. открыла производство фирма Зейберт (Seibert); ее микроскопы славились в конце прошлого столетия. Около 1872 г. в Гёттингене открывается оптический институт Винкеля (Winkel), изготовлявший превосходные инструменты и выпустивший флюоритные системы, более дешевые, чем апохроматы, но сохраняющие ряд свойственных им преимуществ. Нет надобности упоминать множество других оптических производств этого периода. Отметим только сыгравшую значительную роль в распространении микроскопа французскую фирму Нашэ (Nachet), микроскопы которой имели в прошлом веке значительное распространение, и австрийскую фирму Рейхерт (С. Reichert) в Вене, основанную в 1876 г., микроскопы которой при хорошем качестве подкупали относительной дешевизной. Несколько своеобразно развивалось производство микроскопов в Англии, где долгое время были распространены громоздкие штативы на треножниках, мало похожие на установившуюся на континенте форму микроскопа.
Обращено было внимание также и на конструкцию штатива микроскопа. Во второй половине прошлого столетия существенную лепту в этом отношении вложил А. И. Бабухин (1835-1891), крупный русский гистолог, основатель московской гистологической школы и одной из первых микробиологических лабораторий, в ходу был даже термин «бабухинский штатив». Прямая колонка микроскопов, характерная для конца прошлого столетия, в нашем столетии приобрела форму изогнутой ручки. Особенно резкие изменения приобрел штатив в последние десятилетия: тубус принял изогнутую форму, винты перенесены под предметный столик; в ряде моделей микроскоп монтируется вместе с лампой, микрофотографическим аппаратом и т. д.
Выдвинутое Брюкке предположение о сложности строения «элементарного организма» - клетки носило априорный характер; фактических данных для такого предположения тогда еще не было. Чтобы клетка в понимании биолога перестала быть простым комочком протоплазмы, нужны были более совершенные методы исследования, чем те способы микроскопического изучения тканей, какие применялись в первой половине прошлого столетия. Но постановка проблемы есть путь к ее решению. Потребность проникновения в тонкое строение клетки побуждала к поискам новых методов микроскопического исследования. Вся последняя четверть прошлого века проходит под знаком усовершенствования микроскопической техники, причем это касается как микроскопа и ряда вспомогательных приборов, так и методики подготовки объектов для изучения.
История микроскопической техники остается пока ненаписанной главой науки. В литературе встречаются лишь случайные и порой неточные справки, касающиеся отдельных деталей. Поэтому написание этой главы книги представило значительные трудности, и она содержит многочисленные пробелы.
Микроскоп, как бы он ни был усовершенствован, не дал бы возможности проникнуть в тонкие гистологические структуры, если бы параллельно с совершенствованием микроскопа не развивалась техника обработки материала, техника изготовления «микроскопического препарата». Микроскописты первой половины XIX в. изучали ткани либо в свежем состоянии, либо в состоянии начального посмертного изменения. Методы подготовки материала ограничивались расщипыванием или раздавливанием тканей и применением таких реактивов, как уксусная кислота, щелочи, йод и редко спирт. Постоянных препаратов в тот период не изготовляли, и это, конечно, очень затрудняло исследование.
Уже во второй четверти прошлого столетия начинаются поиски консервирующих жидкостей, в которых ткани можно было бы сохранить на препарате в течение продолжительного времени. Главным ингредиентом в таких жидкостях была сулема, применявшаяся в большом разведении. В 1839 г. Гудбай (Goodbay) предложил «универсальную консервирующую жидкость» для изготовления постоянных препаратов, содержавшую сулему, поваренную соль и квасцы. Поэтому образцу ряд других микроскопистов пытались создать варианты консервирующих сред для заключения объекта. Но консервирующее действие таких сред было плохим, и их нельзя ставить на один уровень с современными фиксаторами. Положительное их значение заключалось в том, что они выявили преимущество изучения тканей не в воздухе, а в жидкой среде, и поэтому, начиная с сороковых годов, делаются попытки найти удобные среды для заключения объекта. С другой стороны, эти жидкости имели и отрицательное значение. В то время как раньше изучались преимущественно свежие объекты, появление консервирующих жидкостей повело к тому, что исследователь, подвергнув ткань расщипыванию или раздавливанию, заключал ее в консервирующую среду и полагал, что он изготовил «постоянный препарат». В действительности же в этой жидкости ткани подвергались таким изменениям, что строение не сохранялось, и изучались искаженные остатки структуры.
Только в шестидесятых годах начали применяться более рациональные методы заключения объекта в жидкие среды. Удовлетворительным методом явилось заключение в глицерин, которое начали впервые применять в Англии. Наряду с глицерином применялись различные смеси: глицерин с желатиной, глицерин с гуммиарабиком. Эти среды давали несомненное преимущество перед водой и в шестидесятых годах имели широкое применение.
Канадский бальзам (обычная среда для заключения объекта в современной микротехнике) пробовали применять давно. Еще в 1832 г. его пытался использовать Бон (Bond), а в 1835 г, - Причард (J. С. Pritchard, 1786-1848). Но первые попытки применения канадского бальзама давали плохие результаты, так как объекты предварительно подвергались просушиванию. Впервые в 1851 г. английский невролог Кларк (Jacob A. L. Clarke, 1817-1880), изготовляя препараты мозга, попытался обойти высушивание и использовал обезвоживание препарата спиртом, а затем просветление его в скипидаре. Тем не менее еще в 1868 г. английский микроскопист Бил (L. S. В. Beal, 1828- 1906) в руководстве микротехники указывает, что при применении канадского бальзама объект должен быть высушен при высокой температуре. Метод Кларка также не давал хороших результатов, так как обезвоживание было недостаточным. В 1865 г. немецкий патологоанатом Риндфлейш (Rindfleisch, 1836-1908) предложил применять гвоздичное масло, а в 1863 г. русский гистолог К. З. Кучин (1834-1895), а позже дерптский анатом Л. X. Штида (1837-1918) применили креозот. Штида также ввел в употребление бергамотное масло. При плохом обезвоживании эти средства давали вначале недостаточные результаты (лучше других был креозот, допускающий меньшее обезвоживание). Только в семидесятых годах, когда научились производить достаточное обезвоживание объекта, канадский бальзам получает преимущество перед другими средами и находит широкое применение.
Однако основным недостатком старой техники изготовления постоянных препаратов было отсутствие фиксации. Методы фиксации возникли на основе методики уплотнения тканей. Для изготовления срезов из мягких тканей исследователи искали средства их уплотнения. Одним из первых уплотняющие жидкости начал применять Пуркине. В 40-50-х годах уплотнение тканей для изготовления разрезов становится общепринятым.
В 1840 г. датский анатом и патолог Ганновер (Adolph Н. Hannover, 1814-1894) помещает в «Мюллеровском архиве» статью о «хромовой кислоте, превосходном средстве для микроскопических исследований», и с этого времени хромовая кислота является одним из употребительнейших реактивов для уплотнения, а в дальнейшем - и фиксации животных тканей. Позже для этой цели начинает применяться двухромокислый калий. В поисках лучших средств для сохранения структуры тканей микроскописты пытаются составлять сложные фиксаторы, в состав которых входят различные ингредиенты. Г. Мюллер (Н. Muller, 1820-1864), профессор анатомии в Вюрцбурге, известный своими исследованиями по анатомии глаза, предложил в 1859 г. уплотняющую жидкость, из комбинации двухромокислого калия и сернокислого натрия, знаменитую «мюллеровскую жидкость», в течение многих лет являвшуюся распространенным гистологическим фиксатором. В конце 60-х годов французский гистолог Ранвье (Louis A. Ranvier, 1835-1922) предложил для уплотнения и фиксации пикриновую кислоту, которая нашла в дальнейшем широкое признание.
Значительный прогресс в фиксации тканей был достигнут применением для этой цели сулемы. В консервирующих жидкостях она употреблялась давно, но там ее концентрация была недостаточна для фиксации тканей. В качестве фиксатора сулема вошла в гистологическую технику лишь после 1878 г., когда швейцарский зоолог Ланг (Arnold Lang, 1855-1914) предложил применять ее в концентрированных растворах и в комбинации с уксусной кислотой. Для фиксации тонких гистологических структур сулему впервые употребил выдающийся немецкий физиолог Рудольф Гейденгайн (Rudolf Heidenhain, 1834-1897) в 1888 г. Ингредиенты для составления фиксаторов обогатились далее введением в гистологическую технику осмиевой кислоты (Макс Шульце, 1864), сохраняющей особенно хорошо липоидные структуры клетки. Применение осмиевой кислоты в качестве фиксатора в комбинации с другими реактивами широко вошло в обиход гистологической техники. Флеш (Max Flesch) в 1879 г. предложил комбинацию хромовой и осмиевой кислот, а в 1882 г. Флемминг, один из крупнейших гистологов конца прошлого века (с его именем мы встретимся дальше), предложил свою известную фиксирующую жидкость. Вплоть до 70-х годов микроскописты говорили не о фиксации, а о консервировании и уплотнении тканей. Термин «фиксация» и связанное с ним понятие входит в употребление только в начале 80-х годов. В состав флемминговской жидкости входили хромовая, осмиевая и уксусная кислоты; она долгое время считалась лучшим фиксатором для изучения тонкого строения клеток. Современные фиксирующие жидкости Шампи и Мевеса представляют собой ее модификацию. В 1894 г. К. Ценкер (К. Zenker) предложил свое видоизменение мюллеровской жидкости, добавив к ней сулему и уксусную кислоту. Эта ценкеровская жидкость и теперь остается одним из лучших и употребительнейших фиксаторов. В 1893 г. Блум (F. Blum) вводит в употребление формалин, получивший в дальнейшем широкое применение как фиксатор.
Таким образом, к 80-м годам гистология обогащается значительным арсеналом фиксаторов, сохраняющих структуру тканей; отходит на задний план изучение тканей в свежем состоянии; с каждым годом пополняется список реактивов, применяемых для фиксации гистологических объектов; множатся бесчисленные предложения о составе фиксирующих жидкостей и смесей, из которых только небольшое количество прочно вошло в микроскопическую практику.
В этом развитии микроскопической техники нельзя не отметить отрицательного момента. Во-первых, успехи методов фиксации привели к тому, что исследование свежего материала было заброшено; структуры фиксированной протоплазмы некритически воспринимались как прижизненные структуры, и на этой почве было немало увлечений и сделано немало ошибок. Сама методика фиксации развивалась эмпирически: исследователи, пробуя тот или другой фиксатор, часто не исходили из научных оснований, а бессистемно отыскивали практически пригодные реактивы.
Так как уже с XVIII в. начали применять для микроскопии проходящий свет, возникает необходимость соответствующей обработки объекта. Исследователи первой половины XIX в. пытались обойти эту трудность изучением тонких пленок или кусочков ткани, подвергнутых расщипыванию иглами или раздавливанию. Это грубо нарушало структуру тканей. По отношению к более плотным тканям для получения тонких прозрачных пластинок давно начали применять бритву. Мягкие ткани для приготовления из них срезов с помощью бритвы зажимали в мякоть ветки бузины или в уплотненную долгим пребыванием в хромовой кислоте печень. В середине прошлого столетия для изготовления срезов стали применять заливку в более плотные среды. В пятидесятых годах ботаник Фенцль (Eduard Fenzl) предложил для этой цели парафин в 1856 г. Бёттхер (А. В. Bottcher, 1831-1889), профессор в Дерпте, начал применять желатину. Вначале при заливании в парафин не получалось пропитывания объекта, и, естественно, такая заливка не давала хороших результатов. В конце 70-х годов начинают применять промежуточные среды: гвоздичное масло, креозот, бергамотное масло, ксилол; но только с введением заливки в термостатах (W. Giesbrecht, 1881) применение парафина дало хорошие результаты и вошло в постоянный обиход микроскопической техники. В 1879 г. французский гистолог Дюваль (Mathias Duval, 1844-1907) предложил новую среду для заливания объектов - коллодий. Немецкий гистолог Шиффердеккер (Paul Schiefferdecker, 1849-1931) заменил коллодий целлоидином, занявшим, наряду с парафином, прочное место в качестве среды для заливки объектов с целью получения тонких срезов.
Так как приготовление тонких срезов ручной бритвой требовало большого искусства и все же толщина их была слишком велика, возникает мысль о конструкции специального прибора для получения тонких срезов - микротома. Одна из первых попыток такого рода - «резательная машина» была по конструкции Каммингса описана Дж. Гиллом. Было и еще несколько аналогичных не удержавшихся конструкций Г Современный микротом ведет свое начало от микротома Ошатца (ученика Пуркине), сконструированного в 1844 г. Усовершенствованный немецким анатомом Велькером (Hermann Welcker, 1822-1897), микротом до конца прошлого столетия претерпел многочисленные реконструкции. Первые, так называемые цилиндрические, микротомы представляли собою объектодержатель, передвигавшийся при помощи микрометрического винта; срезы делались ручной бритвой, которую при изготовлении срезов проводили по платформе, расположенной в верхней части микротома. Вплоть до последней четверти XIX в. микротом не пользовался распространением, так как не было удовлетворительной методики заливки объектов с достаточным пропитыванием кусочков органов и тканей. Лишь в семидесятых годах, благодаря работам Гиса (Wilhelm His, 1831 - 1904), микротом начинает находить широкое применение и к концу прошлого столетия окончательно вытесняет изготовление срезов от руки. Применение микротома дало возможность изготовлять тонкие срезы и получать непрерывные серии срезов, что знаменовало собою большой успех в микроскопической технике.
Если, изучая ткани прижизненно, можно было заметить некоторые структуры, пользуясь неодинаковым преломлением света отдельными частями препарата (возникающим особенно при частичном отмирании тканей), то и эти ограниченные возможности были сведены на нет применением методов уплотнения и фиксации. Необходимо было найти способы выявления различных частей клетки после фиксации тканей и это было достигнуто применением окраски срезов. В 1858 году Корти (A. Corti, 1822-1876), исследуя (1854) орган слуха, важнейшая часть которого была названа его именем, употребил для окраски микроскопических препаратов кармин. Для ботанических объектов кармин был употреблен еще ранее Гёппертом и Коном (Goeppert und Cohn) в 1849 г. и Гартингом (Pieter Н. Harting, 1812-1885) в 1854 г. Но действительное распространение кармин получил лишь с 1858 г., когда Герлах (Josef Gerlach, 1820-1895) предложил рецепт аммиачного кармина. Ранвье, Гренахер (Н. Grenadier, 1879) и Пауль Мейер (Paul Meyer, 1881) разработали способы применения кармина в качестве красителя, специфически окрашивающего ядра, и в 80-х годах кармин был излюбленным красителем, которым пользовались в повседневной микроскопической технике.
В 1865 г. Бёмер (F. Bohmer) вводит в гистологическую технику новый краситель - гематоксилин, но вплоть до 90-х годов он не выдерживает конкуренции с кармином. Наоборот, с девяностых годов гематоксилиновая техника делает значительные успехи, постепенно гематоксилин вытесняет кармин и становится обычнейшей «ядерной» краской. Особое значение приобрел метод окраски гематоксилином с протравой железными квасцами, разработанный выдающимся гистологом конца XIX в. Мартином Гейденгайном в 1892 г. Этот метод и в настоящее время принадлежит к числу лучших способов окраски тончайших структур клеток.
Наконец, в 60-х годах начали употреблять для окраски микроскопических препаратов анилиновые красители, которые с 70-80-х годов находят широкое применение. Например, индигокармин введен в гистологическую технику Меркелем (Merkel) в 1874 г., эозин - Фишером (Ernst Fischer) в 1875 г., кислый фуксин - Эрлихом (Paul Ehrlich) в 1880 г., сафранин - Германом (Е. Hermann) в 1881 г.
Микроскопия обогащается новым арсеналом средств для выявления различных тканевых и клеточных структур, которые при применении надлежащих методов фиксации и окраски предстают перед наблюдателем с такой ясностью, о которой микроскописты первой половины XIX в. не могли даже и мечтать.
Упомянем о времени введения в микроскопическую технику некоторых других употребительных методов. Окраска гематоксилином и пикрофуксином введена Ван-Гизоном (Ira Thompson van Gieson, 1866-1913) в 1889 г.; широко известный метод окраски соединительной ткани по Маллори (Frank В. Mallory, 1862-1941) в оригинальной модификации предложен в 1900 г:, а его видоизменение - азановый метод М. Гейденгайн ввел в 1915 г. Столь употребительная теперь нуклеиновая реакция по Фёльгену (Robert Feulgen, 1884-1955) предложена в 1923 г. Применение методов серебрения начало широко внедряться после работ Гольджи, первая из которых опубликована в 1873 г. Метод серебрения Бильшовского (М. Bielschowsky, 1869-11940) предложен в 1903-1904 гг. Метиленовый синий для исследования нервной системы вошел в употребление после работ А. С. Догеля (1852-1922) и А. Е. Смирнова (1859-1910), произведенных в казанской лаборатории К. А. Арнштейна (1840-1919) и опубликованных в 1887 г.
На фиксированных, нарезанных на микротоме и окрашенных тончайших срезах перед взором микроскопистов конца XIX в. открылся целый таинственный мир расцвеченных в различные цвета структур. И гистологи конца прошлого века с увлечением принялись описывать эти невиданные структуры, открывать все новые и новые детали тонкого строения клетки. Порой это были действительно важные структурные части, порой с таким же увлечением описывались артефакты, искусственные образования, вызванные действием фиксаторов или дальнейшей обработкой препарата.
Вся последняя четверть истекшего столетия прошла под лозунгом проникновения в детали тонкого строения клетки. Накапливается громадный материал, учение о строении клетки обособляется в самостоятельную ветвь биологии - цитологию. В то время как в начале XIX в. учение о клетке разрабатывалось отдельными учеными, теперь цитология разрабатывается многочисленными исследователями. Крупные открытия являются обычно результатом целого ряда работ, и выяснить долю участия отдельных ученых в разработке той или другой проблемы является делом подчас трудным, подчас и невозможным. Мы дадим в последующем изложении исторический очерк успехов цитологии, сосредоточив внимание только на некоторых проблемах.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .
Учреждение образования
Лабораторная работа №1
Проверил
Ст.преподаватель
____________Титенкова
Н. И.
«__»
_________ 2011
Выполнила
Студентка
группы ТЭТ-101
____________
Лобкова М. Ю.
«__»
_________ 2011
Могилев
2011
Министерство
образования Республики
Беларусь
Учреждение
образования
МОГИЛЕВСКИЙ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
КАФЕДРА «ТЕХНОЛОГИИ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»
Микробиологическая лаборатория. Микроскоп и техника микроскопирования
Лабораторная работа №1
Специальность 1-25010901 «Товароведение и экспертиза продовольственных товаров»
Проверил
Ст.преподаватель
____________Титенкова
Н. И.
«__»
_________ 2011
Выполнила
Студентка
группы ТЭТ-101
____________
Шевцова Е. Н.
«__»
_________ 2011
Могилев
2011
ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА № 1.
Микробиологическая лаборатория. Микроскоп и техника микроскопирования
Цель: Ознакомление студентов с назначением, устройством, оборудованием и режимом работы микробиологической лаборатории; освоение техники микроскопии микробиологических препаратов.
Контрольные вопросы:
- Назначение микробиологической
лаборатории, ее устройство и оснащение.
Микробиологические исследования осуществляются в специальных помещениях, называемых микробиологической лабораторией. В состав микробиологической лаборатории входят несколько помещений:
1 - лабораторная комната для исследований;
2 - комната для приготовления питательных сред;
3 - комната для мойки посуды (моечная);
4 - комната для стерилизации посуды, питательных сред
(стерилизационная);
5 - бокс – изолированная комната для проведения работ, требующих повышенной степени стерильности. Для этого перед работой воздух и другие предметы, находящиеся в нем, обеззараживаются.
Оборудование микробиологической лаборатории
К оборудованию микробиологической лаборатории относятся приборы оптические (микроскопы, лупы), приборы термические (термостаты, автоклавы, аппараты Коха, сушильные шкафы, холодильники, микробиологические (бактериологические иглы, петли, шпатели) и хирургические инструменты (скальпели, пинцеты, держатели, ножницы), а также пробирки, чашки Петри, покровные и предметные стекла, стеклянные трубочки, капельницы с красителями. В лаборатории необходимо наличие питательных сред (сухой питательный агар, среда Кесслер, среда Эндо), агар-агара, желатина, аналиновых красителей (фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий, метиленовый голубой), различные кислоты, щелочи, сода.
Рисунок 1 - Микробиологическая посуда: а- чашка Петри; б- стекло предметное; в- стекло покровное; г- игла микробиологическая; д- петля микробиологическая; е- шпатель Дригальского.
- Как
должно быть оборудовано
рабочее место микробиолога?
- Какие
существуют методы микробиологических
исследований и какие
из них применяются
для микробиологического
анализа пищевых продуктов?
- бактериоскопическое (микроскопическое) – изучение с помощью микроскопа формы и строения микроорганизмов;
- бактериологическое – изучение культур микроорганизмов путем культивирования, т.е. выращивания на искусственных питательных средах;
- экспериментальное – определение микроорганизмов и их ядов путем заражений ими подопытных животных (мышей, белых крыс, морских свинок). Чаще всего используется для идентификации возбудителя пищевых отравлений;
- серологическое – определение микроорганизмов при помощи сыворотки крови, содержащей антитела. Этот метод широко используется в медицинской микробиологии.
При микробиологическом анализе пищевых продуктов применяются первые два вида исследований. Методом бактериологического исследования определяют культуральные признаки (размер, форму, структуру, цвет, блеск, профиль отдельной колонии) и биохимические особенности микроорганизмов (способность сбраживать вещество, входящее в состав различных питательных сред). При бактериоскопическом исследовании определяют морфологические особенности (размер, форму и т.д.) отдельных микроорганизмов и их способность окрашиваться различными красителями (тинкториальные свойства). Поскольку в природе существует много микробов-двойников, похожих по внешнему виду друг на друга, поэтому для определения вида микроорганизмов одной бактериоскопии обычно недостаточно, необходимо применение бактериологического метода исследования.
- Каковы
правила работы в лаборатории
микробиологии?
При работе в микробиологической лаборатории следует соблюдать следующие правила:
а) находиться в помещении лаборатории и работать в ней обязательно в халате;
б) пользоваться постоянным рабочим местом;
в) следить за порядком на рабочем месте, не держать на нем никаких посторонних предметов;
г) пинцеты, шпатели, микробиологические петли и иглы, пипетки после работы с микроорганизмами прожигать в пламени спиртовки или погружать в сосуд с дезинфицирующим раствором (хлорамин, дизол, карболовая кислота);
д) все использованные материалы с микроорганизмами – отработанные препараты из живых культур, временные препараты и др. – вначале обезвредить стерилизацией или дезинфекцией и только после этого мыть;
е) по окончании занятий привести в порядок рабочее место, снять халаты, и после этого обязательно вымыть руки.
В лаборатории запрещается:
а) находиться в головных уборах и верхней одежде;
б) работать без халатов;
в) принимать пищу, пить воду, курить;
г) класть на столы посторонние предметы;
д) касаться немытыми руками лица;
е) избегать лишнего хождения, резких движений, сквозняков, способствующих загрязнению исследуемого материала посторонней микрофлорой.
5) Опишите устройство биологического иммерсионного микроскопа.
Величина большинства микроорганизмов измеряется микронами, или микрометрами (1 мкм = 1 ? 10 -6 и = 1 ? 10 -3 мм), поэтому рассмотреть и изучить их можно только с помощью специальных оптических приборов - микроскопов.
Принцип работы биологического иммерсионного микроскопа заключается в получении действительного обратного изображения предмета в проходящем или искусственном свете.
В микроскопе различают три части – механическую, оптическую и осветительную (см. рис.1).
Механическая часть, или штатив, состоит из опорной части - основания микроскопа 1 и тубусодержателя 2, на котором укреплены предметный столик 3, кронштейн конденсора 4 и зеркало (или осветитель) 5, а в верхней части - головка 6, наклонный тубус 7 и револьвер 8 с объективами.
Предметный столик служит для закрепления на нем рассматриваемого предмета (препарата), он может перемещаться в горизонтальной плоскости с помощью винтов 9.
Рисунок 2- Микроскоп «Биолам Р 1У4.2»
Фокусировка
препарата достигается перемещением
тубуса с помощью механизма, который
приводится в движение двумя винтами
– макрометрическим 10 (грубая фокусировка)
и микрометрическим 11 (тонкая фокусировка).
Одним оборотом микрометрического винта
тубус передвигается на 0,1 мм. При вращении
винтов по часовой стрелке тубус микроскопа
опускается, при вращении против часовой
стрелки - поднимается.
Внимание!
Микрометрический винт - одна из наиболее
хрупких частей микроскопа и обращаться
с ним нужно наиболее осторожно!
Оптическая
часть микроскопа представлена объективами
12 и окуляром 13.
Объектив
- это основная часть микроскопа.
Он состоит из системы линз, заключенных
в металлическую оправу. Увеличение
объектива зависит от фокусного
расстояния передней (фронтальной) линзы
– единственной линзы, дающей увеличение.
Чем больше кривизна фронтальной
линзы, тем короче фокусное расстояние
и тем больше увеличение объектива.
Расположенные над ней корреляционные
линзы предназначены для получения более
четкого изображения (устранения дефектов
изображения – сферической и хроматической
аберраций). Увеличение, которое дают объективы,
указано цифрами на их оправе.
В
зависимости от степени даваемого
увеличения объективы делятся на
объективы малого, среднего и большого
увеличений.
6)
Как определяется
общее увеличение
микроскопа?
Общее
увеличение микроскопа определяется произведением
увеличения объектива на увеличение
окуляра. Например, если увеличение
объектива 90 х, а окуляра 15 х,
то общее увеличение равно 1350 х.
Осветительное
устройство расположено под предметным
столиком. Его назначение – освещение
поля зрения препарата. В осветительном
устройстве различают зеркало, либо
осветитель, и конденсор с ирисовой
диафрагмой 14.
Конденсор
представляет собой систему сильных
линз и служит для усиления яркости
освещения рассматриваемого объекта.
Он собирает отраженные от зеркала
лучи света в пучок и концентрирует
их в плоскости препарата. Передвигается
конденсор в вертикальном направлении
при помощи винта 15. При опускании
конденсора поле зрения микроскопа затемняется,
при поднятии – освещается.
Ирисовая
диафрагма расположена под конденсором.
Она состоит из тонких металлических
сегментов, которые при помощи рычажка
можно сдвигать или раздвигать, регулируя
этим поступление света в конденсор.
7)
Что такое сухие
и иммерсионные
объективы?
Объективы
малого увеличения (3 х, 5 х, 8 х,
9 х, 10 х) применяют главным образом
для предварительного осмотра препарата.
Объективы среднего увеличения (20 х,
40 х, 60 х) – для изучения крупных
клеток микроорганизмов (например, грибов).
Эти объективы называют сухими, поскольку
при микроскопии между фронтальной линзой
и препаратом находится воздух. Вследствие
различия показателей преломления воздуха
(n = 1) и стекла (n = 1,52) часть лучей, освещающих
препарат, рассеивается и не попадает
в объектив.
Объективы
больших увеличений (85 х, 90 х)
называются иммерсионными. Их применяют
для изучения мелких форм микроорганизмов
(например, бактерий). При работе с ними
препарат должен быть максимально освещен.
Светорассеивание, неизбежное при работе
с объективами, в данном случае устраняется
благодаря использованию иммерсионных
жидкостей, показатель преломления которых
близок к показателю преломления стекла.
Чаще всего используют кедровое масло,
у которого n=1,515. Каплю жидкости наносят
на препарат и погружают в нее объектив.
Короткое фокусное расстояние объективов
большого увеличения ((1,9 - 2,1)мм) позволяет
исследовать объект, не поднимая объектив
из капли, вследствие чего создается однородная
среда между линзой и препаратом.
Окуляр
состоит из двух линз, заключенных
в общую металлическую оправу.
Верхняя линза называется глазной, нижняя
– собирательной. Окуляр лишь увеличивает
изображение, даваемое объективом. Микроскопы
системы «Биолам» снабжены окулярами,
дающими увеличение 7 х, 10 х
и 15 х (цифры указаны на оправе).
8)
Что означает понятие
«разрешающая способность»
микроскопа? Какова
разрешающая способность
микроскопа серии
«Биолам»?
Основной
технической характеристикой микроскопа
является разрешающая способность
– т.е. минимальное расстояние между
двумя точками рассматриваемого
предмета, на котором они не сливаются
в одну и предмет виден отчетливо.
В лабораторной практике наиболее широко
используются биологические иммерсионные
микроскопы серии «Биолам», позволяющие
получить увеличение объекта до 1800 раз.
Их предельная разрешающая способность
равна 0,21 мкм, следовательно, пользуясь
этими микроскопами, можно рассматривать
объекты величиной не менее 0,21 мкм.
9)
Каковы правила
микроскопии препарата?
Микроскопию
препаратов всегда начинают с установки
света. При работе в дневное время
пользуются естественным освещением,
однако чаще прибегают к источникам
искусственного света, которые обеспечивают
регулируемое освещение (осветители ОИ-19,
ОИ-35).
При
установке света конденсор должен
быть поднят до упора, ирисовая диафрагма
открыта. Настройка освещения производится
с объективом малого увеличения (8 х).
Его опускают на расстояние около 0,5 см
от предметного столика, затем, глядя в
окуляр и вращая зеркало, добиваются равномерного
яркого освещения всего поля зрения.
Приготовленный
препарат помещают на предметный столик,
укрепляют клеммами. Микроскопию
начинают с обзорного просмотра
препарата при малом увеличении.
При этом, наблюдая сбоку, опускают
объектив при помощи макрометрического
винта на расстояние около 1 см от предметного
столика. Глядя в окуляр, и медленно вращая
макроскопический винт, поднимают тубус
до появления отчетливых контуров препарата.
Для точной фокусировки пользуются микрометрическим
винтом, который вращают не более чем на
четверть оборота. На этом этапе при исследовании
бактерий можно, медленно передвигая препарат
на предметном столике, найти наиболее
подходящее для микроскопии поле зрения:
участок препарата, на котором микроорганизмы
находятся в достаточном для просмотра
количества, располагаются в один слой,
равномерно.
При
микроскопии со средним увеличением
заменяют объектив малого увеличения
на объективы 40 х или 60 х. О центрированном
положении объектива свидетельствует
щелчок фиксатора внутри револьвера. Глядя
в окуляр, еще более медленно поднимают
тубус до появления изображения и уточняют
фокус микрометрическим винтом.
Микроскопия
при большом увеличении (объектив
90 х) проводится с иммерсионным маслом,
каплю которого наносят на препарат. Затем
заменяют сухой объектив на иммерсионный,
под контролем глаза (вид сбоку) погружая
его в масло почти до соприкосновения
фронтальной линзы с предметным стеклом.
Глядя в окуляр, макрометрическим винтом
слегка поднимают тубус до появления изображения
препарата, а затем с помощью микроскопического
винта добиваются его фокусировки.
По
окончании работы поднимают тубус,
снимают с предметного столика
препарат, опускают конденсор и тщательно
удаляют сухой хлопчатобумажной
салфеткой масло с фронтальной
линзы иммерсионного объектива.
Остатки иммерсионного масла
могут повредить линзу и ухудшить
изображение при микроскопии.
При
микроскопии возможны следующие
ошибки:
-
неполное освещение поля зрения
вследствие неправильного положения
зеркала или неправильного положения
объектива (передвинут на револьвере
микроскопа не до щелчка);
-
тусклое освещение поля зрения
при неправильном положении зеркала,
при опущенном конденсоре или
закрытой диафрагме, а также
при недостаточном количестве
иммерсионного масла на препарате;
-
отсутствие резкости в изображении
предмета – препарат не в
фокусе.
Вывод:
Ознакомились с назначением, устройством,
оборудованием и режимом работы микробиологической
лаборатории; освоили технику микроскопии
микробиологических препаратов.
Министерство
образования Республики
Беларусь
Учреждение
образования
МОГИЛЕВСКИЙ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
КАФЕДРА «ТЕХНОЛОГИИ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»
Лабораторная работа №2
Специальность 1-25010901 «Товароведение и экспертиза продовольственных товаров»
Проверил
Ст.преподаватель
____________Титенкова
Н. И.
«__»
_________ 2011
Выполнила
Студентка
группы ТЭТ-101
____________
Лобкова М. Ю.
«__»
_________ 2011
Могилев
2011
Министерство
образования Республики
Беларусь
Учреждение
образования
МОГИЛЕВСКИЙ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
КАФЕДРА «ТЕХНОЛОГИИ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»
Изучение
морфологии бактерий,
встречаемых в пищевой
промышленности.
Правила работы с
культурами микроорганизмов
Лабораторная работа №2
Специальность 1-25010901 «Товароведение и экспертиза продовольственных товаров»
Проверил
Ст.преподаватель
____________Титенкова
Н. И.
«__»
_________ 2011
Выполнила
Студентка
группы ТЭТ-101
____________
Шевцова Е. Н.
«__»
_________ 2011
Могилев 2011
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2.
Изучение морфологии бактерий, встречаемых в пищевойпромышленности. Правила работы с культурами микроорганизмов
Цель:
Ознакомление с морфологией бактерий,
часто встречающихся в пищевой промышленности,
и методами ее изучения под микроскопом
в прижизненных и фиксированных окрашенных
препаратах; ознакомление с правилами
обращения с культурами микроорганизмов.
Материалы
и оборудование:
микроскоп, предметные
стекла с луночками и без них, покровные
стекла, спиртовки, растворы красителей,
микробиологические петли, иммерсионное
масло, чистые культуры бактерий.
ПРАКТИЧЕСКАЯ
ЧАСТЬ
Приготовили
фиксированные препараты, окрасили их
по методу Грама и рассмотрели с иммерсионным
объективом. Рассчитали общее увеличение
микроскопа: 90 х
х15 х =1350 х.
В результате получили следующее:
микрококки,
гр(+)
стафилококки, гр(+)
палочки,
гр(+)
Контрольные
вопросы:
- Правила
работы с культурами
микроорганизмов.
При приготовлении препаратов микроорганизмов, а также при их посевах и пересевах необходимо строго соблюдать правила и порядок работы. Все работы с культурами микроорганизмов необходимо проводить в пламени спиртовки. С питательной среды микроорганизмы берутся микробиологической петлей, которая предварительно обжигается (фламбируется) в пламени спиртовки.
Порядок работы должен быть следующим:
Зажечь спиртовку.
Взять пробирку с культурой и поместить ее так, чтобы она находилась между большим и указательным пальцем левой руки, поддерживалась средним пальцем и находилась в наклонном положении.
Взять правой рукой микробиологическую петлю, прокалить ее в пламени спиртовки, держа вертикально.
Правой рукой, плотно зажав ватную пробку между мизинцем и ладонью, вращательным движением повернуть пробку, вынуть ее из пробирки и держать концом вниз, следя за тем, чтобы она не касалась окружающих предметов.
Обжечь края пробирки.
Ввести остывшую петлю в пробирку и взять небольшое количество микробной массы, слегка прикасаясь к культуре и не царапая плотную питательную среду петлей. Если микроорганизмы выращены в жидкой питательной среде, то берется петлей капля жидкости.
Снова обжечь в пламени горелки края пробирки, часть ватной пробки и закрыть пробирку пробкой.
Взятый материал эмульгировать в имеющейся на предметном стекле капле воды и равномерно тонким слоем распределить по поверхности (готовят мазок).
Снова обжечь петлю в пламени, чтобы уничтожить оставшиеся в ней микроорганизмы.
- Как
приготовить препараты
для прижизненной микроскопии
микробов? Каковы преимущества
и недостатки этого
метода?
1 Препарат «висячая капля». Небольшую каплю взвеси микробных клеток наносят на покровное стекло и осторожно накладывают на него предметное стекло так, чтобы капля свободно помещалась в центре углубления. Края луночек предварительно смазывают вазелином, препарат переворачивают и микроскопируют. Этот метод применяют, главным образом, для изучения подвижности микроорганизмов.
2 Препарат «раздавленная капля» неокрашенный (нативный). На предметное стекло наносят каплю жидкости (при работе с бактериями - водопроводную воду, при работе с микроскопическими грибами - смесь равных объемов этилового спирта и глицерина), вносят в нее немного исследуемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом, осторожно накладывая его по ребру во избежание образования пузырьков. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Выращенные на плотной питательной среде бактерии переносят в каплю жидкости с помощью бактериологической иглы, а микроскопические грибы - двумя препаровальными иглами. Культура, выращенная в жидкой среде, например, дрожжи, помещается на предметное стекло стерильной пипеткой без предварительного нанесения капли жидкости. Микроскопируют препарат сухими объективами. Препарат позволяет установить форму клеток преимущественно крупных микроорганизмов, их размеры, расположение, подвижность.
3 Препарат «раздавленная капля» прижизненно окрашенных микроорганизмов. К капле микробной суспензии на предметном стекле добавляют каплю слабого раствора (1:1000) красителя (метиленового синего или фуксина), размешивают, затем накрывают покровным стеклом.
и т.д.................
РАЗДЕЛ: ЦИТОЛОГИЯ
ТЕМА : «УСТРОЙСТВО СВЕТОВОГО МИКРОСКОПА И ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ».
Форма организации учебного процесса: практическое занятие.
Место проведения: учебная комната.
Цель занятия: на основании знания устройства светового микроскопа освоить технику микроскопирования и приготовления временных препаратов.
Значимость изучаемой темы
Световая микроскопия – один из объективных методов биологических, медико-биологических и медицинских дисциплинах. Умение правильно пользоваться микроскопом, грамотно оценивать, интерпретировать, документировать (зарисовывать) наблюдаемую микроскопическую картину являются обязательным условием успешного освоения материала на практических занятиях по биологии, гистологии, патологической анатомии, микробиологии.
В результате работы на практическом занятии студент должен
знать:
устройство светового микроскопа;
правила работы со световым микроскопом.
уметь:
работать со световым микроскопом на малом и большом увеличениях;
готовить временный препарат;
оформлять зарисовки микроскопических препаратов;
оформлять протокол занятия.
Оснащение занятия:
Компьютер;
Проектор;
Презентация PowerPointпо теме;
Световой микроскоп;
Бинокуляр;
Микропрепараты (любые);
Предметные стекла;
Покровные стекла;
Чашки Петри;
Скальпель;
Марлевые салфетки;
Фильтровальная бумага;
Спиртовый раствор йода;
Луковица.
Практическая часть занятия
Работа № 1. Устройство светового микроскопа.
Задание 1:
внимательно прочитайте содержание работы № 1 и изучите устройство светового микроскопа.
Рассмотрите основные части микроскопа: механическую, оптическую, осветительную.
К механической части относятся: штатив, предметный столик, тубус, револьвер, макро- и микрометрические винты.
Штатив состоит из массивного подковообразного основания, придающего микроскопу необходимую устойчивость. От середины основания вверх отходит тубусодержатель, изогнутый почти под прямым углом, к нему прикреплен тубус, расположенный наклонно.
На штативе укреплен предметный столик с круглым отверстием в середине. На столик помещают рассматриваемый объект (отсюда название «предметный»). На столике имеются два зажима, или клеммы, неподвижно фиксирующие препарат. По бокам столика расположены два винта – препаратовыделители, при вращении которых столик передвигаются вместе с объективом в горизонтальной плоскости. Через отверстие в середине столика проходит пучок света, позволяющий рассматривать объект в проходящем свете.
На боковых сторонах штатива, ниже предметного столика, найдите два винта, служащие для передвижения тубуса. Макрометрический винт, или кремальера, имеет большой диск и при вращении поднимает или опускает тубус для ориентировочной наводки на фокус. Микрометрический винт, имеющий наружный диск меньшего диаметра, при вращении перемещает тубус незначительно и служит для точной наводки на фокус. Вращать микрометрический винт можно только на полоборота в обе стороны.
Оптическая часть микроскопа представлена окулярами и объективами.
Окуляр (от лат. oculus- глаз) находится в верхней части тубуса и обращен к глазу. Окуляр представляет собой систему линз, заключенных в металлическую гильзу цилиндрической формы. По цифре на верхней поверхности окуляра можно судить о кратности его увеличения (Х 7, Х 10, Х 15). Окуляр можно вынимать из тубуса и заменять по мере надобности другим.
На противоположной стороне найдите вращающуюся пластинку, или револьвер (от лат. revolvo- вращаю), в которой имеется 3 гнезда для объективов. Как и окуляр, объектив представляет собой систему линз, заключенных в общую металлическую оправу. Объектив ввинчивается в гнездо револьвера. Объективы также имеют различную кратность увеличения, которая обозначается цифрой на его боковой поверхности. Различают: объектив малого увеличения (Х 8), объектив большого увеличения (Х 40) и имерсионный объектив, используемый для изучения наиболее мелких объектов (Х 90).
Общее увеличение микроскопа равно увеличению окуляра, умноженному на увеличение объектива. Таким образом, световой микроскоп имеет максимальную кратность увеличения 15 Х 90 или может максимально увеличивать в 1350 раз.
Осветительная часть микроскопа состоит из зеркала, конденсора и диафрагмы.
Зеркало укреплено на штативе ниже предметного столика и благодаря подвижному креплению его можно вращать в любом направлении. Это дает возможность использовать источники света, расположенные в различных направлениях по отношению к микроскопу, и направлять пучок света на объект через отверстие в предметном столике. Зеркало имеет две поверхности: вогнутую и плоскую. Вогнутая поверхность сильнее концентрирует световые лучи и поэтому используется при более слабом, искусственном освещении.
Конденсор находится между зеркалом и предметным столиком, он состоит двух-трех линз, заключенных в общую оправу. Пучок света, отбрасываемый зеркалом, проходит через систему линз конденсора. Меняя положение конденсора (выше, ниже), можно изменить интенсивность освещенности объекта. Для перемещения конденсора служит винт, расположенный кпереди от макро и микровинтов. При опускании конденсора освещенность уменьшается, при поднимании – увеличивается. Диафрагма, вмонтированная в нижнюю часть конденсора, также служит для регуляции освещения. Эта диафрагма состоит из ряда пластинок, расположенных по кругу и частично перекрывающих друг друга таким образом, что в центре остается отверстие для прохождения светового пучка. С помощью специальной ручки, расположенной на конденсоре с правой стороны, можно менять положение пластинок диафрагмы относительно друг друга и таким образом уменьшать или увеличивать отверстие и, следовательно, регулировать освещенность.
Задание 2:
Задание 3:
в рабочей тетради письменно дайте ответы на вопросы для самоконтроля.
Вопросы для самоконтроля:
Какие детали светового микроскопа относятся к механической части?
Какие детали светового микроскопа относятся к оптической части?
Какие детали светового микроскопа относятся к осветительной части?
Укажите, какой кратности увеличения могут быть объективы?
Укажите, какой кратности увеличения могут быть окуляры?
Как называется объектив, кратностью увеличения х90?
Какую кратность увеличения имеет объектив «большого» увеличения?
Как можно найти общую кратность увеличения микроскопа?
Какую роль выполняет конденсор?
Для чего нужна диафрагма?
В каких случаях используется вогнутая поверхность зеркала?
Микроскоп - это оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза.
Разрешающая способность микроскопа дает раздельное изображение двух близких друг другу линий. Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм или 100 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0,2 мкм или 200 нм.
Разрешающая способность и увеличение не одно и тоже. Если с помощью светового микроскопа получить фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,2 мкм, то, как бы не увеличивать изображение, линии будут сливаться в одну. Можно получить большое увеличение, но не улучшить его разрешение.
Различают полезное и бесполезное увеличения . Под полезным понимают такое увеличение наблюдаемого объекта, при котором можно выявить новые детали его строения. Бесполезное - это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения. Например, если изображение, полученное с помощью микроскопа, увеличить еще во много раз, спроецировав его на экран, то новые, более тонкие детали строения при этом не выявятся, а лишь соответственно увеличатся размеры имеющихся структур.
В учебных лабораториях обычно используют световые микроскопы , на которых микропрепараты рассматриваются с использованием естественного или искусственного света. Наиболее распространены световые биологические микроскопы: БИОЛАМ, МИКМЕД, МБР (микроскоп биологический рабочий), МБИ (микроскоп биологический исследовательский) и МБС (микроскоп биологический стереоскопический). Они дают увеличение в пределах от 56 до 1350 раз. Стереомикроскоп (МБС) обеспечивает подлинно объемное восприятие микрообъекта и увеличивает от 3,5 до 88 раз.
В микроскопе выделяют две системы: оптическую и механическую. К оптической системе относят объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель).
Устройство световых микроскопов изображено на рис. 1.
Рис. 1. Устройство световых микроскопов:
А - МИКМЕД-1; Б - БИОЛАМ.
1 - окуляр, 2 - тубус, 3 - тубусодержатель, 4 - винт грубой наводки, 5 - микрометренный винт, 6 - подставка, 7 - зеркало, 8 - конденсор, ирисовая диафрагма и светофильтр, 9 - предметный столик, 10 - револьверное устройство, 11 - объектив, 12 - корпус коллекторной линзы, 13 - патрон с лампой, 14 - источник электропитания.
Объектив - одна из важнейших частей микроскопа, поскольку он определяет полезное увеличение объекта. Объектив состоит из металлического цилиндра с вмонтированными в него линзами, число которых может быть различным. Увеличение объектива обозначено на нем цифрами. В учебных целях используют обычно объективы х8 и х40. Качество объектива определяет его разрешающая способность.
Окуляр устроен намного проще объектива. Он состоит из 2-3 линз, вмонтированных в металлический цилиндр. Между линзами расположена постоянная диафрагма, определяющая границы поля зрения. Нижняя линза фокусирует изображение объекта, построенное объективом в плоскости диафрагмы, а верхняя служит непосредственно для наблюдения. Увеличение окуляров обозначено на них цифрами: х7, х10, х15. Окуляры не выявляют новых деталей строения, и в этом отношении их увеличение бесполезно . Таким образом, окуляр, подобно лупе, дает прямое, мнимое, увеличенное изображение наблюдаемого объекта, построенное объективом.
Для определения общего увеличения микроскопа следует умножить увеличение объектива на увеличение окуляра.
Осветительное устройство состоит из зеркала или электроосветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и светофильтром, расположенных под предметным столиком. Они предназначены для освещения объекта пучком света.
Зеркало служит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Оно имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. В лабораториях с рассеянным светом используют вогнутое зеркало.
Электроосветитель устанавливается под конденсором в гнездо подставки.
Конденсор состоит из 2-3 линз, вставленных в металлический цилиндр. При подъеме или опускании его с помощью специального винта соответственно конденсируется или рассеивается свет, падающий от зеркала на объект.
Ирисовая диафрагма расположена между зеркалом и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фронтальной линзы объектива и состоит из тонких металлических пластинок. С помощью рычажка их можно то соединить, полностью закрывая нижнюю линзу конденсора, то развести, увеличивая поток света.
Кольцо с матовым стеклом или светофильтром уменьшает освещенность объекта. Оно расположено под диафрагмой и передвигается в горизонтальной плоскости.
Механическая система микроскопа состоит из подставки, коробки с микрометренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя, винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора, револьвера, предметного столика.
Подставка - это основание микроскопа.
Коробка с микрометренным механизмом , построенном на принципе взаимодействующих шестерен, прикреплена к подставке неподвижно. Микрометренный винт служит для незначительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива на расстояния, измеряемые микрометрами. Полный оборот микрометренного винта передвигает тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на одно деление опускает или поднимает тубусодержатель на 2 мкм. Во избежание порчи микрометренного механизма разрешается крутить микрометренный винт в одну сторону не более чем на половину оборота .
Тубус или трубка - цилиндр, в который сверху вставляют окуляры. Тубус подвижно соединен с головкой тубусодержателя, его фиксируют стопорным винтом в определенном положении. Ослабив стопорный винт, тубус можно снять.
Револьвер предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчиваются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка, расположенная внутри револьвера.
Винт грубой наводки используют для значительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении.
Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. В середине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора. На столике имеются две пружинистые клеммы - зажимы, закрепляющие препарат.
Кронштейн конденсора подвижно присоединен к коробке микрометренного механизма. Его можно поднять или опустить при помощи винта, вращающего зубчатое колесо, входящее в пазы рейки с гребенчатой нарезкой.
